Tom Hanks, Odbačen

U Republici Hrvatskoj, testiranja na biljege krvlju prenosivih hepatitisa i HIV-a počela su se provoditi već ranih 80-tih godina prošlog tisućljeća. Tako se od 1971. u nas testiraju biljezi na virusni hepatitis B (u svijetu od 1969.), od 1987. testiraju se i  krvni biljezi na prisustvo HIV-a, od 1993. testira se krv na prisustvo HCV biljega (anti-HCV), a od 2005. započeta su tzv. “'kombo’ testiranja i na antigene virusa hepatitisa C i HIV-a (HCVAg i p24Ag).

Od tada do danas razvoj informatizacije i automatizacije doveo je do velikog napretka u kvaliteti testiranja, tako da su u dijagnostici zastupljeni testovi koji se izvode na automatskim analizatorima s automatskom interpretacijom rezultata testiranja, uz odličnu osjetljivost i specifičnost testova kojima se broj mogućih lažnih reaktivnosti svodi na minimum.

Prvotni enzim-imunološki testovi, koji su otkrivali antitijela i antigene uzročnika hepatitisa i HIV-a, koriste se i danas, ali u naprednijem obliku, a dopunjeni su kombiniranim testovima koji simultano otkrivaju i antitijela i antigene za HCV i HIV te su ujedno u stanju otkriti pre-sero-konverzijsku fazu infekcije. Ujedno su pojačani modernim metodama molekularne dijagnostike (NAT i RT-PCR) kojima se asimptomatsko razdoblje, tj. vrijeme od dana zaraze do mjerljivog dokaza zaraze u krvi, maksimalno skraćuje s nekadašnjih više mjeseci pa i pola godine na svega par dana.

Posljednjih dvadesetak godina, nakon otkrića pet najčešćih hepatotropnih virusa (virusi s afinitetom prema jetrenim stanicama) koji uzrokuju akutne i kronične upale jetre (HAV – Picornavirus, HBV – Hepadnavirus, HCV – Flavivirus, HD – Delta nekompletan virus, HEV – Calcivirus), primjenom imunoloških metoda serološke dijagnostike (dokaz antigena virusa i protutijela domaćina u krvnim uzorcima) i otkrićem metoda molekularne dijagnostike kojima se dokazuju virusni genom, broj kopija i genotip virusa u ispitivanom serumu, nastupilo je doba moderne dijagnostike i terapije virusnih hepatitisa s neslućenim mogućnostima kao alatom za vođenje i praćenje terapije tih bolesti.

Testovi koji se koriste za serološko testiranje biljega hepatitisa B, C i HIV-a zasnivaju se na principu otkrivanja antigena i/ili protutijela na uzročne patogene koja se nalaze u serumu ili plazmi (tekućem dijelu krvnog tkiva) inficiranih osoba i bolesnika oboljelih od tih zaraznih, krvlju prenosivih, bolesti te se serološka dijagnostika hepatitisa.

Da bi se otkrilo koji je virus uzrokovao hepatitis, provode se testovi iz uzorka krvnog seruma /plazme. Za dokaz seroloških markera (biljega) na hepatotropne, ali i neke nehepatotropne viruse (Adenovirusi, Cytomegalovirus, Epstein-Bar virus, Herpes simplex virus i drugi), koriste se enzimimunološke metode testiranja novih generacija, koje odlikuje visoka specifičnost i osjetljivost, ponovljivost, brzo i jednostavno izvođenje. Takvim testiranjem uzorka od 5 do 10 mL krvi rezultat je gotov za par sati.

Hepatitis A širi se feko-oralnim putem, a danas se rizičnim skupinama smatraju putnici u zemlje s lošim higijenskim prilikama i pripadnici homoseksualne populacije.

Nakon nešto više od mjesec dana od infekcije HAV virusom (poznat i kao bolest prljavih ruku) u krvi se mogu otkriti protutijela ant-IgM i anti-IgG. IgM nestaju za oko šest mjeseci od nastupa akutne infekcije, dok IgG protutijela ostaju doživotno prisutna u krvi u niskim količinama kao rezultat imunosnog odgovora nakon preboljelog hepatitisa A.

Za osobe koje imaju pozitivan nalaz anti-HAV IgG smatra se da su ili prokužene ili, u slučaju da su cijepljene HAV cjepivom, imaju zaštitni titar anti-HAV protutijela u krvi. Dodatni testovi se koriste za dokaz HAV virusne RNA (RT- PCR metoda).

Filogenetskim analizama genoma metodama molekularne biologije danas se zna kako postoji 10 različitih genotipova hepatitis B virusa klasificiranih prema slovima abecede od A do J, kao i više od 40 podtipova koji su različito geografski distribuirani. Među njima postoje razlike i u putovima prijenosa  te virološke razlike koje su rezultat evolucijske prilagodbe sojeva. Genotip ima utjecaj na progresiju bolesti, pouzdanost dijagnostike i na izbor antivirusne terapije. Što se tiče stupnja virulentnosti, poznato je kako genotip C hepatitis B virusa u oboljelih uzrokuje znatno ozbiljnije posljedice u odnosu na ostale genotipove.

Pojedinim testovima (EIA, RIA, NAT, PCR) kojima se otkrivaju, potvrđuju i prate količina, pojava i nestajanje seroloških biljega u krvi osobe zaražene s HBV-om, moguće je utvrditi i predvidjeti i stadij infekcije i stupanj infektivnosti osobe te tijek bolesti (ide li u kroničnu formu ili k samoizlječenju). Uz to, osnovu dijagnostike akutnog hepatitisa B i dalje čini interpretacija nalaza jetrenih enzima ALT i AST te vrijednosti bilirubina i protrombinskog vremena u krvi.

Prvi i najvažniji biljeg koji se javlja nakon izlaganja virusu je HBsAntigen, koji se pojavi dva tjedna do dva mjeseca prije kliničkih simptoma bolesti. Osim virusa, u serumu i stanicama jetre u zaraženih osoba nalazi se mnoštvo subvirusnih čestica koje su vrlo imunogene (pomažu proizvodnju antitijela), ali nisu zarazne jer ne sadrže virusnu DNA.

Hrvatska pripada u zemlje niske pojavnosti, s manje od dva posto zaraženih stanovnika ovim virusom. Od 1982. postoji cjepivo protiv hepatitis B infekcije koje je uvršteno u program cijepljenja djece, a njime se cijepe i osobe koje pripadaju rizičnim skupinama. Međutim, ova bolest je i u svijetu i kod nas još uvijek jedan od najvećih zdravstvenih problema današnjice. U ranoj fazi hepatitis B akutne infekcije iz krvi je moguće dokazati antigene HBsAg i HbeAg, zajedno ili pojedinačno. Nakon pojave antigena među prvim protutijelima se javljaju anti-HBc IgM  protutijela, a kasnije i IgG klasa istih. Nastankom tzv. serokonverzije dolazi do nestanka antigena i pojave specifičnih anti-HBe i zaštitnih anti-HBs protutijela, a iz krvi nestaje IgM anti-HBc. Nakon preboljenja hepatitisa B u krvi doživotno ostaju anti-HBc i anti-HBs protutijela, a ponekad i anti-HBe.

Uz pregled bolesnika, za dijagnostiku je potrebno učiniti i osnovna biokemijska testiranja krvi (hepatogram, bilirubin, albumine, PV) te napraviti testiranje na površinski antigen (HBsAg) virusa. Taj antigen je mjerljiv u krvi u roku četiri do 12 tjedana nakon infekcije. Ako je rezultat pozitivan valja provesti i dodatne pretrage, procijeniti dužinu trajanja i druge karakteristike bolesti (hepatitisa B) kako bi se poduzelo odgovarajuće liječenje. Kod spontanog izlječenja hepatitisa B u krvi trajno ostaju prisutna antitijela (anti-HBs). Takve osobe stječu prirodnu imunost protiv hepatitisa B.

U osoba sa slabijim imunitetom, koje su prošle akutnu infekciju, katkad se testiranjem uzorka pronađe izolirani nalaz anti-HBc protutijela koji može biti znak viremije (prisustvo virusa u krvi) niskog stupnja. Dio zaraženih osoba razvije tzv. okultni hepatitis kod kojega nema osnovnog biljega zaraze u krvi (HBs antigen), kao niti HBV DNA, ali se nalaze u jetri. Te su osobe obično bez simptoma, a važno ih je dijagnosticirati jer mogu biti ”lažno” zdravi davatelji krvi, tkiva i organa, budući u njihovoj krvi nema poznatih biljega infekcije.  Ako  nalaz HbsAg ostane pozitivan dulje od šest mjeseci i ne nestaje iz krvi, osoba vrlo vjerojatno boluje od kroničnog B hepatitisa.

Kod infekcija tzv. mutantima virusa hepatitisa B mogući su atipični serološki nalazi pa testiranje treba proširiti molekularnom dijagnostikom. Mutacije HBs antigena mogu dovesti do tzv ”escape” mutanata koje je izrazito teško dijagnosticirati.

Hepatitis B se prenosi spolnim putem, parenteralno preko krvi i sa zaražene trudnice/majke na dijete. Osoba se može inficirati tijekom posjeta stomatologu, kod tetoviranja, pedikiranja, piercinga, akupunkture. U rizične skupine spadaju spolni partneri inficiranih osoba, zdravstveni radnici, intravenozni narkomani i djeca zaraženih majki.

HCV virus je otkriven tek sredinom 1989., a do tada se nazivao tzv. ”non A non B hepatitis” Najčešće se prenosi parenteralnim putem i vrlo  je  čest u ovisnika o  intravenskim drogama. U svijetu se procjenjuje da je virusom hepatitisa C zaraženo oko 2,2 posto svjetskog stanovništva. Velika genetska varijabilnost sprječava znanstvenike da proizvedu učinkovito cjepivo za ovaj RNA virus.

Prevalencija infekcije (broj svih slučajeva pojedine bolesti kod određenog stanovništva u određenom razdoblju) u Europi iznosi 0,5-2 posto. Inkubacija traje od dva tjedna do pola godine. Kad se radi o kroničnoj infekciji, do razvoja komplikacija može potrajati 20 i više godina. Poznato je 7 glavnih genotipova i više od 80 podtipova virusa C, od koji su najčešći euro tipovi 1a, 1b i 2c, dok je genotip 3 najzastupljeniji među rizičnom skupinom ovisnika.
Prema procjenama, u Hrvatskoj kroničnu HCV infekciju ima 35 do 45 tisuća ljudi.  Najčešći genotip u Hrvatskoj je 1b.

Kao probirni test (screening) na hepatitis C u krvi se određuje serološki marker anti-HCV protutijelo. Kombiniranim testom je moguće odrediti i antigen i antitijelo. Antitijela se pojavljuju u serumu u razdoblju sedam do devet tjedana od početka bolesti, a mogu nastati i šest mjeseci nakon infekcije, dok se virusna RNA može dokazati u serumu već tijekom inkubacije.

Za dijagnostiku infekcije  virusom hepatitisa  C rutinski se  testira  prisustvo antitijela na hepatitis C (anti-HCV) u krvi. Pokaže li se test pozitivnim, potrebno je učiniti dodatne potvrdne pretrage na virus kako bi se ustanovilo radi li se o aktivnoj infekciji (molekularna dijagnostika – dokaz virusne RNA te genotipizacija, Western blot te rekombinantni imunoblot test – RIBA).  Kvalitativni i kvantitativni PCR testovi su važni za upravljanje terapijom i provođenje odluka o daljnjem liječenju virusnih upala jetre.

U slučaju hepatitisa D se radi o istodobnoj infekciji s B virusom i nepotpunom virusnom česticom – tzv. hepatitis Delta virusom (HDV) koji se ne može umnožavati bez prisustva površinskog antigena virusa hepatitisa B. Ta bolest je često kronična, a ponekad se razvije i fulminatni oblik upale jetre s teškom kliničkom slikom.

Inkubacija je 15 do 50 dana. U krvi se dokazuje HD antigen koji je pozitivan u cirkulaciji tjedan do dva uz IgM i IgG anti-HDV protutijela. Superinfekcija i HD-koinfekcija B hepatitisa određuje se prema pojavi određenih markera B i D infekcije. HDV infekcija se potvrđuje otkrićem HDV RNA u serumu.

Hepatitis E je endemski oblik hepatitisa, koji se slično A hepatitisu širi feko-oralnim putem.

Serološki se dokazuju anti-HEV specifična protutijela. Od trenutka nastanka do osam mjeseci od nastupa infekcije u krvi se nalazi IgM klasa protutijela koja potom nestaju, a ostaju IgG anti-HEV protutijela koja su u krvi prisutna nekoliko godina. Kao dodatni testovi za otkriće HEV RNA se koristi RT-PCR metoda detekcije, a razvijen je i test za detekciju virusnog antigena u krvi.

Uz visoku osjetljivost i specifičnost, serološka dijagnostika u probiru ima svoje nedvojbene prednosti u smislu brzog i relativno jeftinog načina razlikovanja vrste virusa koji je uzrokovao infekciju jetre. Razvojem molekularne biologije dogodila se revolucija u dijagnostici koja je omogućila dokaz virusnih genoma i drastično skratila vrijeme od trenutka kad se posumnja na stjecanja infekcije i bolesti do dobivanja i potvrde dijagnoze.

Molekularna dijagnostika virusnih hepatitisa je osobito korisna metoda za razlikovanje infektivnosti i neinfektivnosti, nedavne ili kronične infekcije i praćenje rezultata terapije, što se osobito odnosi na dijagnostiku virusnog hepatitisa B i C, a vrlo je značajna i u određivanju zaraze virusima HIV-a i njegovih mutanti i kvazi speciesa.

Osim što se PCR metodom u serumu određuje kvalitativno prisustvo HBV-DNA i HCV-RNA, određuje se broj kopija virusa po mililitru krvi te genotip virusa. Jedna od najvažnijih primjena molekularne dijagnostike je praćenje učinkovitosti terapije u liječenju kroničnih oblika B i C hepatitisa kao i u liječenju HIV-a. Tijekom primjene terapije se u određenim intervalima provjerava broj virusnih čestica u serumu pacijenta i time definira uspješnost terapije.

Određivanje virusnog genotipa ima i veliku epidemiološku važnost jer može pomoći u otkrivanju mogućeg puta i izvora infekcije.

Zahvaljujući molekularnoj dijagnostici poznata su nam dva tipa HIV virusa: HIV 1 i HIV 2 te nekoliko podgrupa, među kojima je za globalnu HIV pandemiju zaslužan najviše tip 1 grupe M.

Od trenutka kada se suvremeni svijet prvi puta suočio s ovim virusom 1981. pa do danas u svijetu je, prema procjenama UNAIDS organizacije, njime inficirano oko 40 milijuna ljudi, od čega pola živi na području Subsaharske Afrike. Po učestalosti je prate Azija (Kina i Indija) te zemlje Zapadne Europe (oko 3 milijuna ljudi u EU  živi s virusom HIV-a), Australija, Sjeverna Amerika, Latinska Amerika i Karibi.

Podaci ECDC-a i WHO za Europu  iz 2019. su zabrinjavajući jer se bilježi porast broja novodijagnosticiranih. U nas je krajem 2019. zabilježeno blizu 2000 osoba inficiranih HIV-om i 551 oboljela osoba od AIDS-a, što nas još uvijek svrstava u zemlje niske učestalosti zaraze HIV-om.

Dijagnosticiranje HIV infekcije se zasniva na nalazu anti-HIV antitijela, proteina virusa i virusne RNA. Postoje brzi testovi za probir velikog broja uzoraka čije rezultate valja potvrditi dijagnostikom veće osjetljivosti i specifičnosti. Rezultati brzih testova su dostupni već za pola sata, a vide se kao promjena boje indikatora.

Od trenutka zaraze do ugradnje virusa u genom  domaćina prođe 12 do 14 sata, a prve novonastale virusne čestice se mogu detektirati već jedan dan nakon infekcije. U roku mjesec dana od trenutka infekcije u 95 posto inficiranih  trebao bi nastati dovoljan broj protutijela, p24 proteinskog virusnog antigena i broj kopija virusne nukelinske kiselina da se otkrije zaraza. Najranije je moguće potvrditi zarazu molekularnim metodama dijagnostike u vremenu od oko dva tjedna od dana nastanka infekcije. Oko tjedan dana nakon otkrića virusne RNA u serumu je moguće dokazati p24 antigen, dok  je za nalaz pozitivnih anti HIV protutijela u krvi je potrebno namanje tri tjedna.

Od potvrdnih testova, koji se odlikuju većom osjetljivošćui i specifičnošću te nižom stopom lažnih rezultata, najčešće se koristi PCR i Western blot testovi, čiji se pozitivan nalaz smatra definitivnoim potvrdom postojanja infekcije.

Problem dijagnostike HIV virusa je njegova velika moć mutacija i nastanka tzv. kvazi-speciesa. Što ranijom dijagnostikom se osiguravaju pravodobno liječenje pacijenata i bolji ishod te duži i kvalitetniji život bolesnika i njihovih partnera.